Zum Bau der Stiftskirche kam es, als Pfalzgraf Rudolf II. (1306-1353) durch sein Testament die Stiftung einer Kirche samt Personal (Kollegiatstift) verfügte. Sein Nachfolger Ruprecht I. (1309-1390) setzte dies 1356 um. Hier sollte für die Wittelsbacher täglich eine Messe gehalten werden und die Kirche eine würdige Grabstätte des Fürstenhauses sein. Ruprecht I., Gründer der Heidelberger Universität (1386), wurde unter Kaiser Karl IV. höchster weltlicher Reichsfürst (Reichsvikar und Erztruchsess). Östlich der alten St. Ägidiuskirche wurde der Chorraum errichtet und gleichzeitig mit dem Bau des Südturms begonnen. Ein 1368 angefertigter Grundstein wurde an der Südseite der Stiftskirche eingebaut und ist dort zu sehen.

Fertiggestellt wurde die Stiftskirche 1400 unter Kurfürst Ruprecht III. (1352-1410; später König Ruprecht I.) und als Marien- oder Liebfrauenkirche geweiht. Ruprecht schenkte der Stiftskirche 1402 eine 99 Zentner schwere Glocke, an die heute die Kaiserglocke erinnert.

Die Ausgestaltung der Stiftskirche mit Wandmalereien erfolgte besonders durch Kurfürst Ludwig III. (1378-1436), der von Heidelberg aus Künste und Wissenschaft förderte sowie den Grundstein zur Bibliotheca Palatina legte. Er ist im Chorraum dargestellt und sein Wappen befindet sich auf dem Schlussstein im Mittelschiff des Langhauses.

Während der Südturm um 1370 als Glocken- und Wachtturm (Campanile) gebaut wurde, vollendete man den Nordturm erst 1489, wie ein Stein mit dieser Jahreszahl in alter Schreibweise im Nordturm zeigt.

Beide Türme hatten zunächst spitze Turmhelme. Erst 1739 wurde der Südturm mit einem Barockhelm und der Turmwohnung versehen. Im Nordturm waren vor der Reformation wertvolle Reliquien untergebracht.

Nach der Vollendung war die Stiftskirche eine Hallenkirche ohne Bestuhlung. Die Menschen standen während des Gottesdienstes. Als Raumteiler gab es einen Lettner (Schranke), der den Bereich der Laien von dem der Geistlichen trennte.

Die Mauer im Zentrum der Stiftskirche trennt seit 300 Jahren die evangelische und die katholische Gemeinde. Sie ist eines der letzten Zeugnisse für das willkürliche „Simultaneum“ in der Kurpfalz.

1368: Grundsteinlegung

1383: Chorweihe

1489: Doppeltürme vollendet

1707: Teilung der Kirche in einen protestantischen und einen katholischen Teil